PCR實(shí)驗(yàn)總是出現(xiàn)假陽(yáng)性，明明沒(méi)有加模板，后面卻擴(kuò)出了產(chǎn)物。如果這種現(xiàn)象頻頻出現(xiàn)，就要注意一下操作環(huán)境了。

這里涉及氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個(gè)小時(shí)。

PCR反應(yīng)過(guò)程中不斷進(jìn)行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中部分空氣形成氣溶膠，攜帶大量的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物(注意，1ng擴(kuò)增產(chǎn)物中可作為模板的DNA片段數(shù)量，超過(guò)1ng起始模板中可擴(kuò)增DNA片段數(shù)量的幾百萬(wàn)倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個(gè)bp，要擴(kuò)增的單拷貝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬(wàn)分之一)。如果在實(shí)驗(yàn)室打開(kāi)含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠就會(huì)涌出，擴(kuò)散到空氣中，從而對(duì)環(huán)境造成污染。

雖然在整個(gè)空間環(huán)境中DNA的含量很低，但由于理論上只要有1個(gè)可做為模板的DNA片段也能PCR擴(kuò)增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對(duì)照也能擴(kuò)增出條帶的原因。

所以在專業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)室(比如臨床PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室)，通常有四區(qū)隔離(或至少是三區(qū)隔離)的要求。

常見(jiàn)的三區(qū)是指：

1、試劑配制區(qū)：PCR反應(yīng)體系的配制區(qū)域。

2、標(biāo)本處理區(qū)：包括擴(kuò)增模板的制備，即提取DNA的地方。

3、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)：進(jìn)行PCR擴(kuò)增的區(qū)域，也是擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析的區(qū)域。

如果將PCR擴(kuò)增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)再次分開(kāi)，就是四區(qū)隔離。四區(qū)隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個(gè)PCR區(qū)域之間的流動(dòng)，較好的方法是每個(gè)區(qū)域隔一幢樓，但操作起來(lái)不現(xiàn)實(shí)，于是便有了針對(duì)不同區(qū)域設(shè)置正負(fù)壓的方法：

試劑配制區(qū)(Ⅰ區(qū))：較潔凈的區(qū)域，保持微正壓使得外界空氣無(wú)法進(jìn)入隔離污染源。并且陰性模板應(yīng)該在此區(qū)加入PCR管并蓋蓋，嚴(yán)禁在此區(qū)域打開(kāi)、存放裝有DNA模板的離心管。

DNA模板添加區(qū)(Ⅱ區(qū))：壓力比Ⅰ區(qū)低，保證內(nèi)部空氣不外泄，以免陽(yáng)性模板的氣溶膠對(duì)外界環(huán)境造成污染。

擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)(Ⅲ區(qū))：保持負(fù)壓，使得內(nèi)部空氣不外泄，以免擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠對(duì)外界環(huán)境造成污染。

操作時(shí)壓力遵循Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進(jìn)行，不可逆向進(jìn)行。

既然PCR三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請(qǐng)注意以下細(xì)節(jié)，思考一下氣溶膠來(lái)自哪里：

1. 每個(gè)區(qū)域都應(yīng)配備專用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶拿電泳室的移液器加模板，陰性對(duì)照擴(kuò)出了很亮的條帶。

2. 每個(gè)區(qū)域都應(yīng)配備專用的移液器吸頭，不可交叉混用。

3. 如果條件允許，在PCRⅢ區(qū)工作結(jié)束后再次進(jìn)入PCR I區(qū)需要更換實(shí)驗(yàn)服、一次性鞋套、帽子、手套。

4. 在PCR I區(qū)、PCRⅡ區(qū)配備帶濾芯吸頭。